NanoMicrobiol NanoBiotechnol, 2023 (1), 202311

DOI:

Review

Bacterial biological systems carrying nanoparticles: a smart solution for gene therapy

Ahmad Gholami 1, 2*

1 Biotechnology Research Center, Shiraz University of Medical Sciences

2 Pharmaceutical Science Research Center, Shiraz University of Medical Sciences

* Correspondence: gholami@sums.ac.ir

Abstract

Gene therapy is one of the most advanced strategies in molecular medicine for the treatment of diseases that so far medical science and pharmacy have not been able to find an effective and appropriate treatment for them. In the process of gene therapy, delivering genetic fragments to the target tissues and cells is one of the most fundamental steps to achieve success. Therefore, in the past years, various technologies have been developed for gene delivery. Gene delivery by using nanoparticles is one of these new technologies that has been able to provide significant successes. But it becomes more appealing when biotechnology and microbiology come to the aid of this process. In recent years, it has been tried to use bacterial cells as living robots to transfer nanoparticles carrying genetic fragments to target tissues and cells. These live micro-robots are now one of the main options in the development of gene delivery and gene therapy.

Keywords: Bacteria; Bactofection; Gene delivery; Gene therapy; Nanoparticles; Plasmid

ژن درمانی یکی از راهکارهای رو به پیشرفت در پزشکی مولکولی در جهت درمان بیماری هایی است که تا کنون علم پزشکی و داروسازی نتوانسه اند برای آنها درمان موثر و مناسبی را بیابند. در فرایند ژن درمانی رساندن قطعه ژنتیکی به بافت و سلول های هدف یکی از اساسی ترین مراحل جهت دست یابی به موفقیت است. لذا در سال های گذشته فناوری های گسترده و متنوعی در جهت ژن رسانی توسعه یافته اند. ژن رسانی با استفاده از نانوذرات یکی از این فناوری های جدید است که در سایه توسعه فناوری های زیست پزشکی توانسته موفقیت های چشم گیری را فراهم اورد. اما موضوع زمانی جذابتر می شود که فناوری های زیستی و علم میکروب شناسی به کمک این فرایند بیایند. در سال های اخیر تلاش شده تا از سلول های باکتری به عنوان ربات های زنده جهت انتقال نانوذرات حامل قطعات ژنتیکی به بافت ها و سلول های هدف استفاده شود. این میکروروبوت های زنده هم اکنون یکی از گزینه های اصلی در توسعه ژن رسانی و ژن درمانی می باشند.

در سال‏های اولیه‏ی هزاره‏ی سوم، آزادسازی DNA پلاسمیدی به درون سلول‏های پستانداران با استفاده از باکتری‏هایی که پاتوژنوسیتی آنها کاهش یافته بود به عنوان یک راه حل جایگزین جهت واکسیناسیون ژنتیکی و ژن درمانی مطرح گردید. در حقیقت با الهام از ایده‏ی واکسیناسیون پیشنهاد شد که انواع خاصی از باکتری‏های تضعیف شده مسئولیت انتقال اختصاصی DNA پلاسمیدی به هسته‏ی سلول‏ها را بر عهده گیرند. این ایده بعدها با موفقیت انجام گردید و تحت اصطلاح «باکتوفسیون» عمومیت پیدا کرد. امروزه واژه‏ی باکتوفکسیون جهت توصیف انتقال اسیدهای نوکلئیک به درون سلول‏های پستانداران به واسطه‏ی باکتری به کار گرفته می‏شود (1). باکتوفکسیون این پتانسیل را دارد که به عنوان راهکاری مطمئن برای انتقال ژن و بیان پروتئین‏های هترولوگ در انواع مختلف سلول‏های پستانداران مورد استفاده قرار گیرد. امروزه این باکتری ها یکی از حامل‏های مهم غیرویروسی جهت انتقال DNA و ژن درمانی هستند. در روند ژن درمانی بر مبنای باکتوفکسیون، باکتری نقش حاملی را ایفا می‏کند که پلاسمید حاوی ژن دلخواه را به سلول میزبان یوکاریوتی انتقال می‏دهد. این روش قابلیت‏های فراوانی از خود نشان داده است و بیان پلاسمید کدکننده‏ی انواع پروتئین های هترولوگ (آنتی‏ژن ها، هورمون‏ها، توکسین‏ها و آنزیم‏ها) در رده های مختلف سلولی فاگوسیت کننده یا غیرفاگوسیت کننده‏ی پستانداران توسط آنها امکان پذیر شده است (2).

فرایند ژن رسانی باکتوفکسیون با ورود باکتری به درون سلول‏های هدف آغاز می‏گردد (3, 4). با لیز شدن اتفاقی – یا القایی – باکتری، پلاسمید درون فضای سیتوپلاسم سلول یوکاریوتی آزاد شده و می‏تواند بیان گردد (5, 6). مطالعات متعددی که به تازگی انجام گرفته نشان می‏دهد که باکتوفکسیون عملاً چه به‏صورت برون تن و چه به صورت درون تن قابلیت انتقال ژن را با استفاده از باکتری‏های متعددی از جمله Shigella flexneri (7)، Salmonella typhi (8)، Listeria monocytogenes (9)، Pseudomonas aeruginosa (10) و سویه‏ی نوترکیب تهاجمی Escherichia coli (4, 11, 12) داراست. این باکتری‏ها برای انجام فرآیند ژن رسانی نیاز به مولکول‏هایی در سطح سلول میزبان دارند تا به‏صورت اختصاصی به آن متصل شوند و همچنین زمانی که وارد سلول شدند برای اثربخشی بهتر می‏بایست توسط عوامل خارجی تخریب شوند تا DNA خود را آزاد کنند. سیستم‏های باکتوفکسیونی مبتنی بر L. monocytogenes از این طریق توانسته‏اند به‏طور موثری مواد ژنتیکی خود را به درون هسته‏ی سلول انتقال دهند (13).

سیستم های بیولوژیک پروکاریوتی به عنوان حامل‏های انتقال ژن مزایای بالقوه‏ی فراوانی دارند (14). یکی از این مزایا سادگی کاربرد آنها و انتقال نسبتا انتخابی ژن توسط آنها است. در اینجا تکثیر باکتری حامل مواد ژنتیکی و همچنین تکثیر خود ماده‏ی ژنتیکی نسبت به سایر روش‏های ژن درمانی با سرعت بیشتر و قیمت بسیار پایین‏تر قابل انجام است. علاوه بر این، مزیت منحصر به فرد باکتوفکسیون حساسیت آن به آنتی بیوتیک‏های موجود است که ما را قادر به کنترل ژن ها پس از تجویز می‏نماید (15). ضمن اینکه باکتری‏ها خودشان می‏توانند درون سلول‏های توموری تکثیر شوند و حتی موجب مهار رشد تومور شوند که این امر در ژن درمانی سرطان بسیار حائز اهمیت است (16, 17). این ویژگی‏های منحصر به فرد باکتری ها موجب شده که طی سال‏های اخیر همواره به عنوان یک حامل انتقال ژن ایده آل مطرح باشند (18).

پیشرفت‏های بشر در زمینه‏ی باکتوفکسیون کماکان روند افزایشی را دنبال می‏کند اما رویکردی که از ترکیب میکروب شناسی با نانوتکنولوژی به دست می‏آید می‏تواند یک گام بزرگ رو‏به جلو در زمینه‏ی ژن درمانی ایجاد نماید (19). یکی از دغدغه های اصلی باکتوفکسیون انتقال DNA از داخل باکتری به درون سلول میزبان است. معمولا این روند مستلزم آن است که باکتری ابتدا لیز شده و سپس پلاسمید آزاد گردد (20). از سوی دیگر، نانوذرات پوشش داده شده با DNA پلاسمیدی می‏توانند محموله ژنتیکی خود را بسیار موثرتر انتقال دهند و سیستم کارآمدتری را برای انتقال آنها به هسته‏ی سلول میزبان فراهم می‏کنند. ترکیب نانوذرات و باکتری‏ها می تواند ابزار بسیار مناسبی جهت انتقال ژن و پروتئین به درون سلول های پستانداران به منظور پایش یا تغییر بیان ژن و تولید پروتئین فراهم آورد. محققین نشان داده‏اند ترکیب نانوذرات و باکتری‏ها می‏تواند جهت عرضه‏ی مولکول‏های دارویی مدل DNA به سلول‏های یوکاریوتی به‏صورت درون تن و برون تن، سیستم هوشمند قابل تأملی را به‏وجود آورد. باکتری‏ها می‏توانند توسط نانوذرات پوشش داده شوند تا این مجموعه پس از اتصال به سطح باکتری به درون بافت‏ها و سلول‏ها انتقال پیدا کند. در واقع در این مدل ژن رسانی، ژن‏ها ابتدا بر سطح نانوذرات بارگذاری می‏شوند و سپس باکتری انتقال دهنده‏ی محموله‏ی نانوذره‏ای که در اصطلاح «میکروبوت» خوانده می‏شود توسط سلول یوکاریوتی برداشت شده و نهایتاً ژن‏های آزاد شده از نانوذرات در سلول میزبان بیان می شوند (21). از آنجایی که میکروبوت‏ها بر سطح خود نانوذرات را حمل می‏نمایند، DNA پلاسمیدی متصل شده به نانوذرات نسبت به روش‏های معمول باکتوفکسیون با سهولت و یکنواختی بسیار بهتری به بخش‏های داخلی سلول دسترسی پیدا می‏کند (22). نتایج لومینسانس نشان داد موش‏هایی که میکروبوت به آنها تزریق شده توانسته‏اند به‏صورت موفقیت آمیزی ژن مدل دارویی را در ارگان های مختلف خود بیان کنند (23). این راه‏کار می‏تواند بدون احتیاج به دستکاری‏های پیچیده‏ی ژنتیکی جهت ارائه‏ی انواع مختلف محموله‏های مولکولی به حیوانات زنده و رده‏های متنوع سلولی مورد استفاده قرار گیرد. سلول‏ها عملکردها و شرایط خود را از طریق فرایندهای متعدد سیگنالینگ داخل سلولی کنترل می‏کنند. این فرایندها معمولاً تحت تأثیر مولکول‏های لیگاندی قرار می‏گیرد که به گیرنده‏های سطح سلول متصل می‏شوند. بدون شک میزان و گستردگی اتصال بین گیرنده و لیگاند بر روی شدت و طول دوره‏ی سیگنالینگ درون سلولی و سایر پیش آمدهای متعاقب آن تأثیر قابل توجهی دارد (24). لیگاندهایی که چندین محل اتصال به گیرنده دارند (که به نام لیگاندهای چند ظرفیتی مشهورند) می‏توانند با اتصال متقاطع با چند گیرنده‏ی سطح سلولی به‏طور بسیار موثرتری فرایندهای سیگنالینگ درون سلولی را تنظیم نمایند (25). نانوذراتی که با آنتی‏بادی های مختلف پوشش داده شده‏اند امکان این را پیدا می‏کنند که همانند لیگاندهای چندظرفیتی عمل نمایند؛ به‏طوری که توانایی اتصال متقاطع با گیرنده‏های اختصاصی سطح سلولی را پیدا کنند. با ایجاد تغییر در اندازه‏ی ذره‏ای، شکل و نوع نانوذره‏ی مهندسی شده می‏توان میزان اتصال متقاطع و پاسخ سلولی متعاقب آن را با دقت زیاد کنترل نمود. مشاهدات اخیر در سیستم‏های بیولوژیک نشان داده است که ویژگی‏های فیزیکوشیمیایی نانوذرات بر روی برداشت غیراختصاصی آنها توسط سلول تأثیرگذار است و بنابراین به‏طور بالقوه بر نحوه‏ی القای پاسخ‏های سلولی نیز موثر است (26). این مطالعات نشان می‏دهد ترکیب نانوذرات و سیستم‏های بیولوژیک باکتریایی تا چه اندازه پتانسیل یکدیگر را افزایش می‏دهند. در حال حاضر زیست شناسان و دانشمندان دانشگاه پوردو با امتزاج هوشمندانه‏ی میکروبیولوژی و نانوتکنولوژی، از باکتری‏ها برای عرضه‏ی نانوذرات پوشش داده شده با ژن استفاده نموده‏اند. برای اینکه سیستم طراحی شده بتواند نقش تأثیرگذاری در ژن درمانی پیدا کند می‏بایست ابتدا اثربخشی باکتری ها به عنوان سیستم عرضه کننده‏ی نانوذره افزایش پیدا کند و به این توانایی دست یابد که نانوذره را به صورت اختصاصی به سلول‏های ویژه‏ی انسانی برساند (19).

میکروبوت ها با راه‏کار هوشمندانه‏ای که اتخاذ نموده‏اند مسیر جدیدی را برای محققین حوزه‏ی نانو باز کرده‏اند که بیان می‏کند امکان رساندن مولکول‏های دیگری غیر از DNA نیز از این طریق امکان‏پذیر است. به عنوان مثال میکروبوت‏ها ممکن است جهت عرضه‏ی هدفمند ملکول‏هایی نظیر هورمون‏ها، آنزیم‏ها، توکسین‏ها و مولکول های SiRNA به‏منظور اهداف درمانی مورد استفاده قرار گیرند (27). به‏علاوه، از آنجایی که ثابت شده است  باکتوفکسیون در درمان ملانوما و کارسینومای کولون و ریه موثر است (28)، این یافته ها می‏تواند برهان خوبی در جهت رویکردهای جدید در درمان تومورها باشد.

یکی از خواص جذاب سیستم‏های بیولوژیک حامل نانوذرات عرضه‏ی هدفمند و اختصاصی به سلول‏هاست که این امر موجب می‏شود دوز نانوذراتی که نیاز است جهت اهداف درمانی تجویز شوند به نحو چشمگیری کاهش پیدا کند. به وضوح می‏توان اثبات کرد که ترکیب سیستم باکتریایی حامل نانوذره به همراه بیان پروتئین نوترکیب در باکتری روش بسیار کارآمدی برای تخریب هدفمند سلول‏های سرطانی است. به طور خاص این واقعیت که بیان ژن درون باکتری علی الخصوص زمانی که وارد سلول میزبان می‏شود قابل بهینه سازی است راهکاری بسیار جذاب را برای دانشمندان به ارمغان می آورد: وقتی که این سیستم وارد سلول سرطانی هدف شد نانوذرات حامل یک پیش داروی نسبتاً غیرسمی نیز به سلول عرضه می‏شود. حال می‏توان باکتری حامل را به گونه ای انتخاب نمود تا پروتئینی را بیان کند که پیش دارو را به فرم قوی تر و سمی تر در می‏آورد. این راه‏کار بسیار جذاب می تواند به صورت کاملا اختصاصی سلول های توموری را از بین ببرد؛ بدون اینکه عوارض روش‏های متداول شیمی درمانی را به دنبال داشته باشد (19).

نتیجه گیری

به‏هرحال باید اذعان کرد که افزایش اثربخشی این رویکرد نوین در ژن درمانی به کمک فناوری نانو و علم میکروب شناسی هنوز در گام‏های اولیه‏ی خود قرار دارد.  به‏منظور افزایش کارآیی ژن رسانی با استفاده از ترکیب باکتری و نانوذرات می‏بایست از سایر مطالعات بیولوژیک و بالینی که با استفاده از باکتری‏ها و نانوذرات انجام شده اطلاعات کامل‏تری حاصل نمود.

فهرست منابع:

1. Baban CK, Cronin M, O’Hanlon D, O’Sullivan GC, Tangney M. Bacteria as vectors for gene therapy of cancer. Bioengineered Bugs. 2010;1(6):385-94.
2. Okafor F, Janen A, Kukhtareva T, Edwards V, Curley M. Green Synthesis of Silver Nanoparticles, Their Characterization, Application and Antibacterial Activity. Int J Env Res Public Health. 2013;10(10):5221-38.
3. Lopez-Ruiz A, Verbelen JP, Roldan JM, Diez J. Nitrate reductase of green algae is located in the pyrenoid. Plant Physiol. 1985;79(4):1006-10.
4. Sultana A, Kumar R. Modified bactofection for efficient and functional DNA delivery using invasive E. coli DH10B vector into human epithelial cell line. J Drug Deliv Sci Technol. 2022;70:103159.
5. Rice KC, Bayles KW. Death’s toolbox: examining the molecular components of bacterial programmed cell death. Molecular microbiology. 2003;50(3):729-38.
6. Sultana A, Tiash S. Improved DNA delivery using invasive E. coli DH10B in human cells by modified bactofection method. J Controlled Release. 2021;332:233-44.
7. Mahdieh M, Zolanvari A, Azimee AS, Mahdieh M. Green biosynthesis of silver nanoparticles by Spirulina platensis. Sci Iranica. 2012;19(3):926-9.
8. Mandal D, Bolander ME, Mukhopadhyay D, Sarkar G, Mukherjee P. The use of microorganisms for the formation of metal nanoparticles and their application. Appl Microbiol Biotechnol. 2006;69(5):485-92.
9. Mohanpuria P, Rana NK, Yadav SK. Biosynthesis of nanoparticles: technological concepts and future applications. J Nanopart Res. 2008;10(3):507-17.
10. Mukherjee P, Roy M, Mandal B, Dey G, Mukherjee P, Ghatak J, et al. Green synthesis of highly stabilized nanocrystalline silver particles by a non-pathogenic and agriculturally important fungus T. asperellum. Nanotechnol. 2008;19(7):075103.
11. Parikh RY, Singh S, Prasad B, Patole MS, Sastry M, Shouche YS. Extracellular synthesis of crystalline silver nanoparticles and molecular evidence of silver resistance from Morganella sp.: towards understanding biochemical synthesis mechanism. ChemBioChem. 2008;9(9):1415-22.
12. Park D, Hill A, Pfeifer BA. Improving E. coli Bactofection by Expression of Bacteriophage ΦX174 Gene E. Bio-Carrier Vectors: Springer; 2021. p. 3-14.
13. Ansari M, Khan H, Khan A, Malik A, Sultan A, Shahid M, et al. Evaluation of antibacterial activity of silver nanoparticles against MSSA and MRSA on isolates from skin infections. Biol Med. 2011;3(2):141-6.
14. Belete TM. The current status of gene therapy for the treatment of cancer. Biologics: targets & therapy. 2021;15: 67–77.
15. Sathishkumar M, Sneha K, Yun Y-S. Immobilization of silver nanoparticles synthesized using Curcuma longa tuber powder and extract on cotton cloth for bactericidal activity. Bioresour Technol. 2010;101(20):7958-65.
16. Alt V, Bechert T, Steinrücke P, Wagener M, Seidel P, Dingeldein E, et al. An in vitro assessment of the antibacterial properties and cytotoxicity of nanoparticulate silver bone cement. Biomaterials. 2004;25(18):4383-91.
17. Lin D, Feng X, Mai B, Li X, Wang F, Liu J, et al. Bacterial-based cancer therapy: An emerging toolbox for targeted drug/gene delivery. Biomaterials. 2021;277:121124.
18. Barwal I, Ranjan P, Kateriya S, Yadav SC. Cellular oxido-reductive proteins of Chlamydomonas reinhardtii control the biosynthesis of silver nanoparticles. J Nanobiotechnol. 2011;9(1):1-12.
19. Dietrich G. Bioengineering: Bacteria give nanoparticles a ride. nature nanotechnology. 2007;2(7):394-5.
20. Ingle A, Rai M, Gade A, Bawaskar M. Fusarium solani: a novel biological agent for the extracellular synthesis of silver nanoparticles. J Nanopart Res. 2009;11(8):2079-85.
21. Jain D, Kachhwaha S, Jain R, Srivastava G, Kothari S. Novel microbial route to synthesize silver nanoparticles using spore crystal mixture of Bacillus thuringiensis. Indian J Exp Biol. 2010;48(11):1152-6.
22. Lee H, Yeo S, Jeong S. Antibacterial effect of nanosized silver colloidal solution on textile fabrics. J Mater Sci. 2003;38(10):2199-204.
23. Akin D, Sturgis J, Ragheb K, Sherman D, Burkholder K, Robinson JP, et al. Bacteria-mediated delivery of nanoparticles and cargo into cells. Nat Nanotechnol. 2007;2(7):441-9.
24. Bhainsa KC, D’Souza S. Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using the fungus Aspergillus fumigatus. Colloids Surf B. 2006;47(2):160-4.
25. Faghri Zonooz N, Salouti M. Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using cell filtrate of Streptomyces sp. ERI-3. Sci Iranica. 2011;18(6):1631-5.
26. Gadd GM. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation. Microbiol. 2010;156(3):609-43.
27. Kalimuthu K, Suresh Babu R, Venkataraman D, Bilal M, Gurunathan S. Biosynthesis of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis. Colloids Surf B. 2008;65(1):150-3.
28. Lara HH, Ayala-Núnez NV, Turrent LdCI, Padilla CR. Bactericidal effect of silver nanoparticles against multidrug-resistant bacteria. World J Microbiol Biotechnol. 2010;26(4):615-21.