NanoMicrobiol NanoBiotechnol, 2023 (1), 202315
DOI:
Original Article
Fabrication of Thymus daenensis herbal nanoparticles through top-down approach
Nahid Moradi1*, Nahal Hadi2
1 Department of Medical Nanotechnology, School of Advanced Medical Sciences and Technologies, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran
2 Department of Bacteriology, school of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran
* Correspondence: n_moradi@sums.ac.ir
Abstract
With the spread of microbial infections resistant to common antibiotic treatments, scientific efforts to obtain new antimicrobial compounds have grown significantly. Meanwhile, the use of antimicrobial nanoparticles has been favored and successful more than other fields. Plant nanoparticles are a new family of antimicrobial nanostructures that have received attention in recent years. The method of making these nanoparticles is top down and usually using ball mills. For this purpose, the dried parts of the plant, which have confirmed antimicrobial properties, are subjected to several stages of grinding. In each stage of grinding, the grinding conditions such as the size of the pellets, the ratio of pellets to the sample and the duration of the grinding are adjusted in such a way that a softer powder is obtained gradually. In the present study, plant nanoparticles were made from dry thin thyme leaves. Electron microscope studies showed that the resulting powder was composed of nano- and micro-scale particles with a wide range of diameters and irregular shapes. It was also found that the obtained plant nanoparticles are mesoporous (average diameter 19 nm). The structures obtained were tested against MRSA and P. aeruginosa as superbugs, and after performing the antibacterial test, the MIC was 20 mg/ml. Due to the mesoporous structure of the plant nanoparticle, it is predicted that it can be functionalized with antimicrobial particles to increase its antibacterial power significantly, and it can be used in the formulation of strong local and surface disinfectants against microbes. Also, the obtained results can be considered for the design and construction of the next generation of reinforced antimicrobial nanostructures.
Key words: Ball mill; Bead beater; Herbal nanoparticles; Nanostructures; Top-down approach
1 مقدمه
گیاه آویشن از خانواده Lamiaceae حاوی حدود 400 گونه معطر می باشد. گیاهی علفی همیشه سبز با انواع زیرگونه ها و اشکال مختلف. آویشن باریک[1] به طور گسترده در طب سنتی کشورهای مختلف به دلیل خواص خلط آور، ضد سرفه، ضد برونکولیتیک، ضد اسپاسم، ضد کرم، ضد نفخ و ادرارآور آن استفاده می شود و مطالعات مختلف با هدف بررسی ترکیب شیمیایی و خواص بیولوژیکی اسانس آن انجام شده است. ترکیب شیمیایی آن به طور متغیر حاوی ژرانیول، لینالول، گاما ترپینئول، کارواکرول، تیمول و غیره است که علاوه بر خواص طعم دهنده تعیین شده توسط مواد تشکیل دهنده فعال، آویشن فعالیت ضد میکروبی و همچنین خواص آنتی اکسیدانی قوی قابل توجهی نشان می دهد. به عنوان مثال در مطالعه ای که در سال 2014 با هدف بررسی ترکیبات شیمیایی و خواص آنتی باکتریال بر روی اسانس آن انجام شده نشان داده شده است که اجزای اصلی p-cymene, γ-terpinene و تیمول بودند. هم چنین فعالیت ضد میکروبی آن بر روی 7 باکتری و قارچ رایج مرتبط با مواد غذایی با استفاده از روش انتشار دیسک ارزیابی شد که نتایج نشان می دهد که اسانس آویشن باریک آزمایش شده دارای خواص ضد میکروبی قوی است و ممکن است در آینده منبع جدیدی از ضد عفونی کننده های طبیعی با کاربرد در صنایع دارویی و غذایی باشد. (1)
آویشن سرشار از مواد مغذی گیاهی، مواد معدنی و ویتامین‌هایی است که برای سلامتی حیاتی هستند. این مواد مغذی به دلیل خواص پیشگیری کننده از بیماری و بهبود سلامتی شناخته شده اند و به فواید این گیاه کمک می کنند. آویشن به ویژه سرشار از ویتامین A و ویتامین C است. ویتامین A یک آنتی اکسیدان است که برای حفظ سلامت غشای مخاطی و پوست و همچنین بینایی مفید شناخته شده است. ویتامین C برای بیماری های عفونی تورزیستین ضروری است و از رادیکال های آزاد مضر التهابی محافظت می کند. آویشن همچنین حاوی ویتامین‌های B کمپلکس، عمدتاً ویتامین B6 (پیریدوکسین) است که به حفظ سطح اسید γ- آمینوبوتیریک (GABA) در مغز کمک می‌کند و به عنوان یک تسکین دهنده استرس عمل می‌کند. ویتامین K، ویتامین E و اسید فولیک نیز در آویشن وجود دارد. آویشن همچنین سرشار از مواد معدنی است که برای سلامتی ضروری هستند. برگ های آن منبع عالی پتاسیم، کلسیم، آهن، منگنز، منیزیم و سلنیوم است. پتاسیم جزء مهم سلول ها و مایعات بدن است و ضربان قلب و فشار خون را کنترل می کند. آهن در تشکیل گلبول های قرمز بسیار مهم است و منگنز یک عامل کمکی برای آنزیم آنتی اکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز است (2).
خواص آنتی اکسیدانی عصاره آویشن در درجه اول به دلیل غنی بودن آن از ترکیبات فنلی است و به توانایی آنها در عمل به عنوان جاذب کننده رادیکال های آزاد، شل کننده یون های فلزی و مهار کننده آنزیم های اکسیداتیو مربوط می شود. توضیح داده شد که ترکیبات فنلی عمدتاً به دلیل خواص اکسیداسیون و کاهش، دارای اثرات آنتی اکسیدانی هستند که میتواند نقش مهمی در جذب و خنثی‌سازی رادیکال‌های آزاد، خاموش کردن اکسیژن منفرد و سه‌گانه یا تجزیه پراکسیدها داشته باشد و مشخص شد که آویشن باریک یکی از گونه های تیموس است که دارای فعالیت آنتی اکسیدانی بالاتری نسبت به سایرین است.
فعالیت آنتی اکسیدانی در شرایط آزمایشگاهی تیمول، یک ترکیب پلی فنلی اصلی در آویشن، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که تیمول فعالیت آنتی اکسیدانی از خود نشان می دهد و ممکن است از طریق کاهش ضایعات چربی ، کاهش استرس اکسیداتیو و لیپیدهای سرم، پیشرفت هیپرلیپیدمی ناشی از رژیم غذایی پرچرب و رواسکلروز را سرکوب کند. اثر آنتی اکسیدانی قوی تیمول از طریق افزایش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی درون زا، مانند سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز، گلوتاتیون-S- ترانسفراز، و سطح سایر آنتی اکسیدان های غیر آنزیمی مانند ویتامینC، ویتامینE و گلوتاتیون کاهش می یابد. بنابراین به طور قابل توجهی وضعیت آنتی اکسیدانی کل را در داخل بدن افزایش می دهد (2).
مانند سایر گیاهان و به دلیل تنوع بیولوژیکی و ساختاری اجزای آن، آویشن نیز میتواند منبع تجدیدپذیری برای ترکیبات مختلف ضد باکتری در نظر گرفته شود که گونه باریک بیشترین بررسی را دارد. در مطالعاتی اثر هم افزایی اسانس آویشن با انتروسین (یک باکتریوسین کوچک و طبیعی) بر روی اشریشیاکولای اثبات گردید. درمان با انتروسین به تنهایی بر روی رشد اشریشیاکولای تاثیری نداشت. اما ترکیب اسانس آویشن و انتروسین یک اثر ضد میکروبی سینرژیک و کاهش حداقل غلظت بازدارنده اسانس را به همراه داشت. در پژوهش هایی فعالیت ضد میکروبی اسانس آویشن بر علیه جنس های استافیلوکوک، انتروکوک، اشریشیا و سودوموناس مقاوم به چند دارویی بالینی که در محیط بیمارستان از عفونت های حفره دهان، حفره شکمی، دستگاه تنفسی، دستگاه تناسلی ادراری و پوست جدا شده اند بررسی گردید. با استفاده از روش انتشار آگار، اسانس آویشن به شدت از رشد سویه های بالینی آزمایش شده جلوگیری می کند، که نشان می دهد ممکن است منطقی باشد که آن را به عنوان یک گیاه دارویی برای درمان و پیشگیری از عفونت های باکتریایی ناشی از گرم مثبت و گرم منفی بررسی کنیم (2).
التهاب یک واکنش پیچیده، طبیعی و حفاظتی بافت های بدن به عنوان مکانیسم دفاعی در برابر محرک های مضر از جمله پاتوژن ها و آسیب های سلولی است. استفاده از آویشن و عصاره های آن به طور سنتی در سراسر جهان برای درمان بیماری های التهابی انجام می شود و مطالعات مختلف خواص ضد التهابی آن را نشان داده اند. نشان داده شد که عصاره آویشن کاهش وابسته به دوز را در تولید و بیان ژن واسطه های پیش التهابی فاکتور نکروز تومور (TNF)-α، IL-1B و IL-6 اعمال می کند که با افزایش ترشح سیتوکین در ماکروفاژهای فعال ضد التهابی همراه است. این عصاره ها قادر به کاهش افزایش القای LPS در سیکلواکسیژناز (COX)-2، فاکتور هسته ای کاپا B (NF-kB)، نیتریک اکسید القایی (NO) سنتاز (iNOS)، TNF-α و NO بودند و یک اثر ضعیف‌کننده قوی‌تر از دگزامتازون برای اکثر واسطه‌های التهابی مورد مطالعه تولید کردند. اسانس آویشن به طور قابل توجهی ترشحات التهابی را در دوزهای 250، 500 و 750 میلی گرم بر کیلوگرم کاهش داد و تعداد سلول های مهاجر را به میزان 750 میلی گرم بر کیلوگرم کاهش داد (2).
فعالیت ضد قارچی آویشن عمدتاً به ترکیبات فنلی، تیمول و کارواکرول کمک می‌کند، جایی که مورد دوم بیش از دو دهه پیش گزارش شد، فعالیت سمی قارچ‌ها در هنگام آزمایش روی میوه‌ها برای مهار رشد قارچ‌ها وجود دارد. با توجه به ظرفیت ضد قارچی، یافته های مطالعات مختلف به دلیل واریانس در کیفیت گیاهی، تغییرات کمی و کیفی ترکیبات اساسی روغن، تفاوت بین سویه های قارچی مورد بررسی و تفاوت های روش شناختی همیشه قابل مقایسه نیستند. یکی از رایج ترین پاتوژن های عفونت قارچی کاندیدا است که برخی از گونه های آن پاتوژن های فرصت طلب هستند و باعث عفونت در میزبان هایی با نقص ایمنی و یا در غیر این صورت آسیب دیده می شوند. عفونت ها ممکن است سطحی یا تهاجمی باشند که مورد دوم احتمالاً تهدید کننده زندگی است. مقاومت به داروهای ضد قارچی در بسیاری از گونه‌ها افزایش یافته است و بر تاثیرات بالینی و درمان بیمار تأثیر منفی می‌گذارد. اسانس آویشن در برابر جدایه های C. albicans مقاوم به فلوکونازول جدا شده از خون یا واژن مورد مطالعه قرار گرفت. به طور موفقیت آمیزی رشد جدایه ها را در محیط های کشت کاهش داد و در دوزهای پایین قارچ ایستا و قارچ کش بود. این روغن همچنین از تشکیل لوله های جوانه و جوانه زدن پاتوژن های قارچی جلوگیری کرد و نسبت به فلوکونازول در برابر ایزوله های مقاوم موثرتر بود. اسانس آویشن از طریق آپوپتوز، تراکم هسته ای و آسیب غشای پلاسمایی فعالیت ضد قارچی خود را نشان داد. علاوه بر این، روغن تولید آفلاتوکسین و بیان ژن را کاهش داد و بر متابولیسم ثانویه و مکانیسم های حدت تأثیر منفی گذاشت .(2)
با توجه به اینکه هم تیمول و هم اسانس آویشن برای مدت طولانی به عنوان خلط آور، ضد التهاب، ضد سرطان، ضد باکتری، ضد عفونی کننده، و ضد ویروسی از نظر درمانی استفاده می شود، جستجوی فعلی برای مسیرهای جدید در فعالیت های بیولوژیکی یا دارویی بسیار امیدوارکننده به نظر می رسد. به همین ترتیب، فرمول‌های جدید آویشن، مانند نانوژل‌ها و میکروامولسیون‌ها، می‌توانند در عمل دارویی مفید باشند و ممکن است فرصت‌هایی برای استفاده بهتر ایجاد کنند. در این راستا و برای به دست آوردن بهترین نتیجه ممکن از این گیاه غنی، رویکردهای نوآورانه و روشی سیستماتیک برای آزمایش آویشن ضروری است. این شامل ایجاد یک روش استاندارد برای مطالعات مولکولی و مکانیکی، علاوه بر انتقال بهتر داده های به دست آمده از آزمایش به کارآزمایی های بالینی است، که هنوز برای این گیاه متعدد نیستند. برای اینکه بتوان از آویشن و ترکیبات آن بهره کامل برد و آنها را به طور کامل فرآوری کرد، به کارآزمایی های بالینی با کیفیت بالا، فاز پیشرفته، تصادفی، کنترل شده با دارونما، چند مرکزی، تصادفی نیاز است (2).
2 مواد و روش ها
2.1 ساخت نانو ذرات گیاهی
برگ های خشک شده آویشن باریک از فروشگاه های محلی خریداری شد. برگ های خریداری شده با آب لوله کشی و سپس با آب دیونیزه شسته شده تا گرد و غبار احتمالی از بین برود. پس از خشک شدن در شرایط محیط، برگ ها با استفاده از آسیاب خانگی پودر شدند. این پودر برای فرایند آسیاب گلوله ای یا سیاره ای آماده شد. برای دستیابی به آسیاب کاری کارآمدتر، این فرآیند در سه مرحله انجام شد (تصویر 1 الی 3). در هر سه مرحله از گلوله های فولادی استفاده شد و نسبت وزن گلوله ها به پودر 20: 1 محاسبه شد.
اولین مرحله با استفاده از گلوله های فولادی 2 سانتی متری با سرعت 450 دور در دقیقه به مدت 15 ساعت انجام شد. مرحله دوم به مدت 25 ساعت به وسیله گلوله های فولادی 1 سانتی متری با سرعت 450 دور در دقیقه انجام شد. در مرحله آخر مخلوطی از گلوله های 0.5 سانتی متری و دو گلوله 1 سانتی متری استفاده شد که به مدت 30 ساعت و با سرعت 300 دور در دقیقه آسیاب کاری ادامه یافت و پودر نهایی با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی تصویر برداری شده است.
3 نتایج
برای ساخت نانوذره گیاهی از آویشن باریک به عنوان یک گیاه ضد میکروبی شناخته شده و قدرتمند انتخاب شد (7-3). پس از فرآیند آسیاب گلوله ای، تجزیه و تحلیل میکروسکوپ الکترونی روبشی گسیل میدانی نشان داد که پودر از ذرات در مقیاس نانو و میکرو با طیف وسیعی از قطرها و اشکال نامنظم تشکیل شده است (تصویر 4 الی 6). این نتیجه بر اساس تکنیک به کار گرفته شده انتظار می رفت. اما برای رسیدن به بهترین نتیجه ممکن با ذرات یکنواخت تر، سه مرحله آسیاب انجام شد. نتایج مشابهی در آزمایش قبلی برای ساخت نانوذره گیاهی با استفاده از گیاهان دیگر گزارش شده بود (14-8).
تصویر 1. تصویر آویشن خریداری شده از عطاری
تصویر 2. تصویر آویشن پس از انجام آسیاب خانگی
تصویر 3. تصویر آویشن پس از سه مرحله آسیاب سیاره ای
تصویر 4. میکروگراف FESEM پس از اتمام مرحله اول آسیاب
تصویر 5. میکروگراف FESEM پس از اتمام مرحله دوم آسیاب
تصویر 6. میکروگراف FESEM نهایی پس از سه مرحله آسیاب
ویژگی های بلوری نانوذرات گیاهی با استفاده از پراش سنجی اشعه ایکس مورد بررسی قرار گرفت (تصویر 7). بر اساس تنظیمات کاربردی که برای جستجوی قله های پراش استفاده می شد، سه و چهار قله پراش به ترتیب برای نانوذره گیاهی و نانوذره عامل دار شده مشخص شد. پراش اشعه ایکس از نانوذره گیاهی در 1.35 ، 43.3 و 57.5 درجه 2- تتا رخ داد. بر اساس نتایج مطالعه حاضر و تحقیقات قبلی می توان نتیجه گرفت که ساختار بلوری نانوذرات گیاهی به شدت وابسته به گیاه مورد استفاده است. نانوذرات حاصل از آلوئه ورا، Azadirachta indica (چریش)، Acalypha indica و Tridax procumbens بی شکل بودند (9 و 10 و13 و14). در همین حال، نانوذراتRhizophora apiculate ، Avicennia marina و Excoecaria agallocha طبیعت کریستالی را به نمایش گذاشتند (15).
تصویر 7. راش پرتو ایکس نانوذرات گیاهی
طیف ATR-FTIR از نانوذره گیاهی در شکل 4 نشان داده شده است. قله پهن cm-1 3307 معمولاً ناشی از گروههای OH است. پیوندهای C-H قله ای را در حدود cm-12921 نشان میدهند و قله در cm-1 1622 به دلیل پیوند C = C حلقوی است (16 و 17). قله تیز و قوی در cm-1 1023 ، قله مشخص پیوند C-O است. طیف های ثبت شده از نانوذره گیاهی شکل 8 مشخصا قله ای در cm-11420 نشان میدهد که به گروه کربوکسیل (–COO-) نسبت داده می شود (18).
تصویر 8. طیف FTIR نانوذرات گیاهی
4 بحث و نتیجه گیری
نانوذرات گیاهی، خانواده جدیدی از نانوذرات می باشند که به تازگی مورد توجه قرار گرفته اند. این نانوذرات به دلیل آنکه از منابع طبیعی حاصل می شوند بسیار زیست سازگار بوده و به نظر می رسد در آینده کاربردهای روزافزونی در علوم و صنایع مختلف پیدا کنند. به عنوان نمونه کاربرد نانوذرات در صنعت نساجی اخیراً به دلیل امکان ترکیب خواص مطلوبی مانند رنگ‌های جذاب، افزایش پایداری، فعالیت ضد باکتریایی و محافظت در برابر اشعه ماوراء بنفش برای پارچه های پوشش داده شده افزایش یافته است. در نتیجه می توان از آن ها در تهیه منسوجات پزشکی و بیمارستانی استفاده کرد. به طور کلی پارچه های بدون پوشش نانوذره به دلیل وجود گروه های هیدروکسیل بر روی سطحشان درجه بالایی از آب دوستی نشان می دهند. در نتیجه، به محض قرار دادن قطرات آب بر روی پارچه نخی، به راحتی توسط سطح پارچه جذب می شود. در مقابل، پارچه هایی که با نانوذرات گیاهی مانند آلوئه ورا و ایندیکای هندی پوشانده می شوند به دلیل انرژی سطحی کمتر که باعث کاهش اندازه منافذ پارچه می شود آب گریزی فوق العاده ای نشان می دهند. طبیعت فوق آب گریز پارچه های با پوشش نانوذره به دلیل اصلاح سطح توسط نانوذره که انرژی سطحی کمتر و توزیع سایز و اتصال یکنواخت دارند می باشد. و نکته قابل توجه این است که حتی پس از چند مرتبه شست و شوی پارچه همچنان این قابلیت آب گریزی پا برجا است. می توان نتیجه گرفت همه پارچه های روکش دار خاصیت مقاومت در برابر آب را حتی پس از شستشوی بعدی حفظ می کنند .(10)
در مطالعه ای بر روی نانوکامپوزیت کایتوزان و آلوئه ورا پارچه های حاوی این نانوکامپوزیت خاصیت ضد ماوراء بنفش قوی نشان دادند که به دلیل وجود ترکیبات فیتوشیمیایی فعال موجود در نانوذره آلوئه ورا است که اشعه ماورابنفش را مسدود می کند. سطح بالای نانوذرات گیاهی آلوئه ورا ممکن است پولاریزاسیون نوری بالایی داشته باشد زیرا از روش آسیاب گلوله ای با انرژی بالا تهیه شده است.
مطالعه بیان می کند که میزان مسدود سازی اشعه توسط پارچه دارای نانوذره پس از ده بار شست و شو به میزان 7 تا 10 درصد کاهش می یابد که در نتیجه حذف اندکی از پوشش از پارچه در طی شست و شو می باشد. اما در هر حال نانوکامپوزیت های گیاهی متشکل از آلوئه ورا و کابتوزان بسیار محافظت کننده در برابر اشعه ماوراء بنفش هستند. (19)
بر اساس داده های استاندارد ASTM D6603، نرخ UPF محاسبه شده برای پارچه های مورد استفاده در مسدود کردن UV بسیار بالاتر از 50 است که این رقم بسیار بالاتر از زمانی است که پوشش بدون آلوئه ورا به کار می رود که تایید کننده خاصیت قوی مسدودکنندگی اشعه توسط نانوذره آلوئه ورا است (19).
نانوذرات گیاهی بدست آمده از گیاهان منتخب فعالیت ضد میکروبی و ضد قارچی قابل توجهی با درجات مختلف نشان داده اند. ارزیابی ضد میکروبی با اندازه نانوذرات گیاهی مطابقت دارد. به عنوان مثال بیشترین مهار با 150 میکرو لیتر نانوذره گیاه مانگرو حدودا 14 نانومتری در برابر باکتری های استافیلوکوکوس آرئوس و باسیلوس و اشریشیاکولی با مناطق مهاری به ترتیب 26 و 23 و 18 میلی متر دیده شده است .(20)
هم چنین پارچه های پوشش یافته با نانوذرات ایندیکا در مقایسه با پارچه های بدون پوشش در برابر اشریشیاکولی و استافیلوکوکوس آرئوس عملکرد ضد میکروبی بسیار بالا نشان داده اند که بیان شده این ویژگی منحصر به فرد به علت وجود ترکیبات فیتوشیمیایی شامل آلکالوئید، تانن، ساپونین و استروئید در برگ گیاه می باشد. قابل ذکر است از این خاصیت نانوذرات بر روی پارچه میتوان در تولید منسوجات پزشکی استفاده نمود.(10)
ترکیب نانوذرات آلوئه ورا و کیتوزان نیز خاصیت کشندگی بسیار قوی در برابر اشریشیاکولی و استافیلوکوکوس آرئوس دارد که به علت وجود ویتامین دی میتوان از آن در درمان زخم به خوبی استفاده کرد. اثر ضد میکروبی بالای نانوذرات آلوئه ورا به دلیل وجود فیتوکمیکال هایی مثل ترپنوئید و ساپونین و تانن است که در برگهای پهن آلوئه ورا موجود می باشند که دارای دامنه فعالیت ضد باکتریایی گسترده در برابر بیماری های باکتریایی است. همچنین یک جز پلی ساکاریدی ، دارای فعالیت ضد میکروبی غیرمستقیم از طریق توانایی آن در تحریک فاگوسیت ها و لکوسیت ها است .(19)
لازم به ذکر است ساختار نانوذرات نقش مهمی در ایجاد خاصیت ضدمیکروبی دارد زیرا تفاوت مورفولوژی میتواند فعالیت ضدباکتری را افزایش دهد. همچنین ممکن است به دلیل ساخت نانوذره گیاهی با این روش که باعث توزیع سایز کمتری می شود، نفوذ آسان این نانوذرات به داخل سلول های باکتریایی منجر به مهار سنتز DNA و همچنین مرگ سلول در بیشتر موارد شود.
منابع
1)Borugă O, Jianu C, Mişcă C, Goleţ I, Gruia AT, Horhat FG. Thymus vulgaris essential oil: chemical composition and antimicrobial activity. Journal of Medicine and Life.2014.
2) Dalal Hammoudi H , Maha K , Sanaa Khaled ,Samar Younes. A Focused Insight into Thyme: Biological, Chemical, and Therapeutic Properties of an Indigenous Mediterranean Herb.Nutrients.2022.
3) El-Sayed S. M., H. S. El-Sayed, Antimicrobial nanoemulsion formulation based on thyme (Thymus vulgaris) essential oil for UF labneh preservation, J. Mater. Res. Technol.2021.
(4) Micucci M., M. Protti, R. Aldini, M. Frosini, I. Corazza, C. Marzetti, L. B. Mattioli, G. Tocci, A. Chiarini, L. Mercolini, Thymus vulgaris L. essential oil solid formulation: chemical profile and spasmolytic and antimicrobial effects, Biomolecules.2020.
(5) Fani M., J. Kohanteb, In vitro antimicrobial activity of Thymus vulgaris essential oil against major oral pathogens, J. Evid. Based Complementary Altern. Med.2017.
(6) Dülger d., ö. Albuz, Antimicrobial Effects of Thymus vulgaris, Cinnamomum zeylanicum and Zingiber officinale essential oils on Salmonella enterica serovar enteritidis infections, Kafkas Univ. Vet. Fak. Dreg.2020.
(7) Radünz M., H. C. dos Santos Hackbart, T. M. Camargo, C. F. P. Nunes, F. A. P. de Barros, J. Dal Magro, P. J. Sanches Filho, E. A. Gandra, A. L. Radünz, E. da Rosa Zavareze, Antimicrobial potential of spray drying encapsulated thyme (Thymus vulgaris) essential oil on the conservation of hamburger-like meat products, Int. J.2020.
(8)Borhan M. Z., R. Ahmad, M. Rusop, S. Abdullah, Optimization of ball milling parameters to produce Centella asiatica herbal nanopowders, J. Nanostr. Chem.2013.
(9)Karthik S., R. Suriyaprabha, K. S. Balu, P. Manivasakan, V. Rajendran, Influence of ball milling on the particle size and antimicrobial properties of Tridax procumbens leaf nanoparticles, IET Nanobiotechnol.2016.
(10) Karthik S., R. Suriyaprabha, M. Vinoth, S. Srither, P. Manivasakan, V. Rajendran, S. Valiyaveettil, Larvicidal, super hydrophobic and antibacterial properties of herbal nanoparticles from Acalypha indica for biomedical applications, RSC Adv.2017.
(11) Kokila R., R. Suriyaprabha, S. Karthik, G. Nandhini, V. Rajendran, Antibacterial and antioxidant potential of herbal nanoparticles produced from the shells of Jatropha Curcas, Adv NanoBio M&D.2017.
(12) Kumar K. V., G. Rosaiah, K. Babu, N. T. Swamy, N. Krishna, A study on antimicrobial properties of herbal nanoparticles of selected mangrove plants, Res. J. Life Sci. Bioinform. Pharm. Chem. Sci.2018.
(13) Subramani K., V. Murugan, B. K. Shanmugam, S. Rangaraj, M. Palanisamy, R. Venkatachalam, V. Suresh, An ecofriendly route to enhance the antibacterial and textural properties of cotton fabrics using herbal nanoparticles from Azadirachta indica (neem), J. Alloys Compd.2017.
(14) Subramani K., B. K. Shanmugam, S. Rangaraj, M. Palanisamy, P. Periasamy, R. Venkatachalam, Screening the UV-blocking and antimicrobial properties of herbal nanoparticles prepared from Aloe vera leaves for textile applications, IET Nanobiotechnol.2017.
(15) Fani M., J. Kohanteb, In vitro antimicrobial activity of Thymus vulgaris essential oil against major oral pathogens, J. Evid. Based Complementary Altern. Med.2017.
(16)Fu J., W. Liu, Z. Hao, X. Wu, J. Yin, A. Panjiyar, X. Liu, J. Shen, H. Wang, Characterization of a low shrinkage dental composite containing bismethylene spiroorthocarbonate expanding monomer, Int. J. Mol. Sci.2014.
(17) Park C.-S., D. H. Kim, B. J. Shin, D. Y. Kim, H.-K. Lee, H.-S. Tae, Conductive polymer synthesis with single-crystallinity via a novel plasma polymerization technique for gas sensor applications, Materials.2016.
(18) Naz S. S., M. R. Shah, N. U. Islam, A. Khan, S. Nazir, S. Qaisar, S. S. Alam, Synthesis and bioactivities of silver nanoparticles capped with 5-Amino-β-resorcylic acid hydrochloride dihydrate, J. Nanobiotechnol.2014.
(19) Karthik.S, S.Rangaraj, Manivasakan, P.Palanisamy, R. Venkatachalam. Screening the UVblocking and antimicrobial properties of herbal nanoparticles prepared from Aloe vera leaves for textile applications. IET Nanobiotechnology.2017.
(20) kovvada.V, k.babu. A study on antimicrobial properties of herbal nanoparticles of selected mangrove plants. research journal of life sciences,bioanformatics,pharmaceutical and chemical sciences.2018.
(21) Moradi.N ,Taghizadeh.S.M, Ghanbariasad.A, Berenjian.A and Ebrahiminezhad.A. Agar Microdilution Procedure: A Promising Technique for Antimicrobial Susceptibility Test of Colloidally Unstable Nanostructures. Nanoscience & Nanotechnology-Asia.2022.
